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提纲：
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR的几种方法介绍
实时荧光定量技术的应用

实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR 原理 实时原理
常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测

实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

实时荧光定量PCR原理定量原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析

介绍三个概念：
扩增曲线、荧光阈值、Ct值

实时荧光定量PCR 原理----------- 扩增曲线


实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值

荧光信号阈值 （threshold ）：
前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值
荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99
真正的信号:荧光信号超过域值

实时荧光定量PCR 原理-------Ct值
Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数

实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性

Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
Ct值则极具重现性

实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
理想的PCR反应：
X=X₀*2ⁿ
非理想的PCR反应：
X=X₀ (1+Ex)ⁿ

n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X₀：初始模板量
Ex：扩增效率

实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线


模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小
Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量

实时荧光定量PCR原理 绝对定量

确定未知样品的 C(t)值
通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
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