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| FAQs>艾德课堂 |
| 008.DHPLC简介 |
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| 用以检测T2DM的众多候选基因突变所需要的技术，既要求能够自动化、高通量进行，也要求除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理；而目前已有的许多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性 (single-strand conformation polymorphism，SSCP) 、变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等均不能满足此要求。近年来建立并迅速发展的DHPLC是一种新型基因突变筛查技术，符合上述的要求，可用于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，小片段缺失或插入等多种基因突变的检测。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统的SSCP 、DGGE等方法相比，DHPLC有较多的优点。SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；DGGE则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。而DHPLC则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。
其原理是：在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。
用DHPLC筛查突变的时候，要注意以下几个方面：
（1）PCR产物要有高度特异性，以免用DHPLC检测时产生假阳性结果。可以使用pfu酶来代替Taq酶，以消除主峰前面那个由于使用Taq酶而出现的杂峰，避免出现假阳性。
（2）退火温度的估算很重要。利用Navigator software计算出的退火温度通常能够筛查到大部分的突变，如果与δ螺旋等计算方法联合应用，来估算退火温度，将更加准确。
（3）当筛查大样本量的时候，要注意经常用已知突变的样本来做对照，检测条件是否合适，以保证良好的重复性。只要保证以上几个方面，用DHPLC就基本可以筛查到100%的SNP以及插入/缺失片断突变。
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作者：Admin 上传日期：2011年06月15日
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