DNA甲基化测定的引物网上设计

最近，继人类基因组计划完成之后，人类基因组外遗传计划正式启动。DNA甲基化便是其中一个为人所熟知的基因外遗传信号。研究发现，DNA甲基化与大多数肿瘤的发生有关。在肿瘤发生的早期已发现许多基因启动子的甲基化状态发生改变。因此，DNA甲基化测定有可能成为一个新的肿瘤分子标志物。而在临床诊断上建立一个快速、准确的检测DNA甲基化的方法非常必要。

目前检测DNA甲基化的方法有很多，其中甲基化特异的PCR（MSP）是检测DNA甲基化状态的准确度较高的方法[1]。理想的引物是MSP扩增成功与否的关键因素之一，它决定着MSP扩增的特异性、扩增的效率和扩增的保真度等。由于MSP是1个较新的方法，目前MSP引物设计软件较少，会设计的人则更少，在国内目前还没有专门设计MSP引物的网站和公司。最近，在国外因特网上出现了一个提供了在线免费MSP引物设计程序"MethPrimer"，它能够根据实验者的要求设计MSP引物。根据我们使用的经验，仅介绍这个免费设计程序的使用方法和有关注意事项。

1．MSP引物设计的原理：标本DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的CpG岛碱基鸟嘌呤（C）不变，即Cm → Cm；而未发生甲基化的CpG岛碱基鸟嘌呤则变为碱基尿嘧啶，即C → U。在引物设计时，我们把处理后的DNA序列中的尿嘧啶替换为胸腺嘧啶，即U→ T来设计甲基化的MSP引物。

2．MSP引物设计的原则：

（1）引物序列中至少应含有1个CpG岛，且该CpG岛应在3ˊ端附近。

（2）引物序列中应含有多个非CpG岛的"C"。

（3）DNA甲基化和非甲基化引物的CpG岛应个数和位置都相同。而其他的原则应尽可能的与普通PCR一致。

3．进入免费在线MSP引物设计程序"MethPrimer"的方法：在主页 http://www.urogene.org/methprimer/index.html 界面中，点击"Go to MethPrimer", 进入"MethPrimer-Design Primers for Methylation PCRs"网页，将需要分析的DNA序列复制粘贴到该网页的方框内，选择Pick MSP Primer，同时在"Use CpG islandprediction for primer selection ?"对话框内对所需条件加以限制，然后点击Submit键，稍后屏幕显示该序列的CpG岛的个数及所需的MSP扩增引物。如果需要重新输入，点击Reset键即可。

在设计引物时遇到问题可在网页上方的"常见问题"（FAQ）和"帮助"（Help）链接中找到答案。

参 考 文 献
1  Liu ZJ, Maekawa M.  PCR-based methods of DNA methylation analysis. Anal Biochem, 2003, 317：259-265.

其他甲基化相关的软件：

1.Methyl Primer Expres-另一个甲基化研究的引物设计软件
这一研究工具主要作用是辅助设计出具有甲基化 (methylation)或硫化 (bisulphite)的特殊聚合酶链锁反应的引物(primers) 。在进行DNA甲基化分析的研究过程中，许多研究人员认为最麻烦也是最花时间的过程，就属设计出具有专一性辨识能力的特异核酸引物，ABI技术人员指出，这一套软件几乎可以在短短五分钟之内，设计出合用的核酸引物。 From xxboy
目前这套专利权仍属于ABI
下载地址：
https://products.appliedbiosyste ... 21&tab=Overview

2.BiQ Analyzer- a softwaretool for easy visualization and quality control of DNA methylation data frombisulfite sequencing.
本软件最大的优点就是整理分析BSP测序后的数据，并能得到BSP研究结果经典的圆心黑点图。
先安装Java，才能安装BiQ.
http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/

3.怎样找到某一个基因的CpG岛序列
http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/

4.推荐甲基化的网站：

http://www.methdb.de/
http://www.sciencemag.org/featur ... res_epigenetics.dtl
www.hopkinsmedicine.org/epigenetics