1.       回收不到质粒DNA或者质粒DNA的回收效率低

可能的原因：

1）     Buffer W2中未加入无水乙醇，应按比例补加无水乙醇。如果是错误地加入了其他试剂，请向我公司技术部寻求帮助。

2）     Buffer W2中错误地加入了70%乙醇。请向我公司技术部寻求帮助。

3）     错误地使用了Buffer W1和Buffer W2的洗涤顺序。确保按正确的顺序洗涤纯化柱。

4）     质粒未转化到宿主菌中。确保从新鲜制备的含抗生素的平板中挑取单克隆菌落接种培养，并确保在培养基中加入对应的抗生素。

5）     Buffer Ⅱ有白色沉淀产生。如有沉淀则应将Buffer II置于37℃水浴直至沉淀溶解后再使用。

6）     Buffer Ⅱ使用完后未盖紧瓶盖，与空气长期接触导致溶菌效率下降。请制备新鲜的Buffer Ⅱ：1% SDS, 0.2M NaOH。

7）     菌体未悬浮充分。菌体未悬浮充分前勿加入Buffer Ⅱ。

8）     DNA的洗脱效率差。参考第4页柱纯化技术中的第4点“洗脱质粒DNA”内容优化DNA的洗脱方案。

9）     分离纯化的是低拷贝质粒。适当增加细菌培养物的用量。

10）  细菌培养物中污染有真菌。确保从新鲜制备的含抗生素的平板中挑取单克隆菌落接种培养。

11）  质粒上插入的基因的表达产物对细菌有毒性，影响了细菌的正常生长。

 

2.       操作步骤中的异常现象：

1）     细菌沉积在管底，难以用漩涡振荡充分悬浮。如果要收集多达5ml细菌培养物，却仍然使用快速收集的菌体（12000 rpm 离心30秒）的方法，会导致收集的菌体难以悬浮，此时可尝试用移液器吸头吹打菌体沉淀的方法悬浮细菌；或者改为3000 rpm 离心5分钟收集菌体。

2）     加入Buffer Ⅱ后，溶液变得非常粘稠，无法流动。通常造成上述原因是细菌用量过多所至，会造成后续的中和步骤操作起来非常困难。但此时如果在Buffer Ⅰ中事先补加有中和指示剂，可在加入Buffer Ⅲ后持续翻转1.5 ml离心管直至溶液沉淀中的蓝色部分全部转换为淡黄色，以确保能达到合适的中和效果。

3）     加入Buffer Ⅱ后，溶液未呈现粘稠的半透明状，而是维持细菌在Buffer I中的浑浊状，无粘滞感。上述现象通常是因为细菌培养物中污染有大量的真菌，或者革兰氏阳性细菌等微生物所致。应确保从新鲜制备的含抗生素的平板中挑取单克隆菌落接种培养，而非用甘油菌接种。

4）    13000rpm 离心10分钟后沉淀不能沉积到管底，呈膨胀物的形式悬浮在液体中。通常是由于加入Buffer Ⅲ后未充分中和所致，请翻转离心管10次后再于13000rpm 离心10分钟。在Buffer I中事先补加中和指示剂，可以确保获得合适的中和效果。

5）     13000 rpm 离心10分钟后沉淀不能沉积到管底，贴在管壁，并伴有漂浮物浮在上清液表面。应怀疑Buffer Ⅱ使用完后未盖紧瓶盖而导致溶菌效果下降，请制备新鲜的Buffer Ⅱ：1% SDS, 0.2M NaOH。

6）     质粒DNA上样电泳时，加入上样孔的DNA溶液不能下沉，上浮飘散开来。通常是因为高速空离（操作步骤 8）没有操作，洗脱的质粒中乙醇含量过多所致。

 

3.       酶切失败

1）     限制性酶切后电泳质粒消失，没有条带，或者电泳条带出现严重的拖尾现象。可能是选用了野生型的或者是end A⁺的宿主菌所致，并且未用Buffer W1洗涤纯化柱。请确保用BufferW1洗涤纯化柱，或者按附录中的方法对质粒DNA作进一步的纯化。

2）     酶切不能完全切开。本试剂盒纯化得到的质粒DNA不存在酶切抑制物，可直接用于酶切（比如20 μl酶切体系中，除去2 μl 10×酶切缓冲液和1 μl限制性内切酶的体积后，可直接加入17 μl洗脱的质粒DNA用于酶切）。如果酶切不能完全切开，应尝试减少质粒DNA的用量，或者增加限制性内切酶的用量，并适当延长酶切时间。

 

4.       电泳质粒DNA电泳带型异常

正常的质粒DNA带型，见图1:

C泳道：空载体pUC19电泳效果。顶部条带 1：二聚体质粒DNA；中间条带 2：含切口的质粒DNA；下部条带 3：超螺旋质粒DNA。

A泳道：空载体pUC19单酶切效果。

B泳道：含插入片段的pUC19双酶切效果。

异常的质粒DNA带型，见图2：

获得的质粒DNA二聚体含量很高，或者纯化的质粒DNA于-20℃储存一段时间后二聚体增多（见图2泳道1）。质粒二聚体或者多聚体含量的增多与选择的宿主菌有关，但是质粒二聚体或者多聚体的存在并不影响质粒DNA酶切的电泳带型（见图2泳道2）。用TE溶液（10mM Tris-HCl, 1mMEDTA, pH 8.0）替代Buffer E或去离子水洗脱质粒DNA后储存于-20℃于有助于减少质粒二聚体的产生。

 

5.  质粒DNA中含有RNA污染

可能的原因：

Buffer Ⅰ中所含的RNase A活性降低。如果加入RNase A的Buffer Ⅰ在2~8℃保存的时间超过6个月，应补充RNase A至终浓度100 μg/ml。

 

6.  质粒DNA中含有细菌基因组DNA的污染

可能的原因：

1）    溶解步骤操作太剧烈：加入Buffer Ⅱ后应温和地翻转离心管使细菌溶解。

2）    溶解步骤停留时间过长：加入Buffer Ⅱ后静置时间不应超过5分钟。

3）    中和步骤操作太剧烈：加入Buffer Ⅲ后应温和地翻转离心管使溶液中和。

4）    细菌的培养时间超过16小时，导致部分细菌出现了溶菌现象。

产品序号：1001050 /1001250

规格	价格
50次制备	150
250次制备	650