| 一、Southern杂交
问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？
解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？
解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb的 DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交 （1）用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl 0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。(3)干胶应立即杂交。先将胶在水中泡一下，以利于操作。(4)将胶放人杂交液(6×SSC、5×Denhardt’S、0.25% SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA)，加人探针，42℃杂交16-20小时。(5)杂交完成后，洗膜8轮，42℃每次15分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗两次，在冰水中浸泡2分钟，以利于盐的排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作，室温压片0.5-2小时。冲片照相。使用的探针为G-CSF。DNA，探针标记采用Fluorescein-12-dUTP，检测试剂盒为杜邦公司产品，操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交的方法，较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题，结果不仅直观，而且特异性好。与常规的Southern杂交相比，它所具有的优势是，它省略了将DNA进行转膜的步骤，从而避免了因转膜不完全所造成的DNA量的损失，特别是低拷贝数基因的丢失。另一方面，也使复杂的Southern杂交操作程序大大简化。因此，在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏检的一种可行途径。
问题3：在向下转膜法中，如何提高转膜效率？
解决方案：1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高于凝胶，短时间内会有大量液体聚集在凝胶上，直接从侧面流失；果转移液的水平面过分低于凝胶，影响纱布的吸水力，转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变形，使吸水纸与滤纸间产生空隙，而降低吸水纸的吸水效率，应及时更换吸水纸。3、过夜转移时，及时添加转移液，防吸干。4、样本丰度高时，移时间可以缩短至1小时，此时凝胶上仍可见大分子量DNA的残留，当样本丰度低时，以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物，防凝胶受压变薄，响转移效率。
问题4：碱转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存，且防止长期保存过程中DNA结合不紧密影响杂交效果，应如何做？
解决方案：将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻，在紫外交联仪中将转有DNA的一面向上12000J交联4 min，若尼龙膜暂不杂交，可在4℃下保存备用但存放时间不宜超过半年。
问题5：使用碱转移法，将导致杂交后探针的去除困难，几乎80%-90%的探针难以洗脱，如何解决这一问题？
解决方案：将煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷却至室温,可除去膜上已杂交的DNA探针。洗脱后的尼龙膜,可反复用于其他探针的杂交(至少可耐5轮杂交与洗脱)。
问题6：Southern杂交中，探针的背景高，应如何解决？
解决方案：用随机引物法标记的探针要想得到最低的背景，在向尼龙膜上加prob-DIG Easy H yb混合物前,要用0.45μm醋酸纤维素膜过滤，勿用硝酸纤维素滤膜过滤。对每一个探针和目的片段，总是要根据经验确定最合适的杂交条件，探针浓度很关键，如果太高，将会非特异性结合到膜上；太低，敏感性会降低。
利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，以下 2 种措施可降低背景：(1)适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；(2)控制地高辛抗体的浓度。使用足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号, 但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。
问题7：Southern杂交没有检测出出杂交信号的原因，如何解决？
解决方案：（1）目的DNA在总DNA中所占的比例，一般需要 10μg DNA 样品, 如果样品中目的基因含量较高, 可以按比例减少DNA用量。如果基因组中目的基因的拷贝数较低, 致使常规的基因组用量不能满足Southern 杂交的需要, 此时可加大基因组的用量；（2）探针的浓度和比活性：在杂交袋中杂交需要0.2ml/cm2的杂交液；使用圆筒状瓶子进行杂交可以使用较小的体积，约 0.1ml/cm2。（3）转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对：（见问题2，3）
二、Western blot中常见问题
问题1： 在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么区别？
选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。Western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。
问题2：没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用来做Western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于Western blotting，因为在Western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏
问题3：做Western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？
最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。
问题4：Western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，如何选择？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献
问题5：为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗？做Western必须要内参吗？
一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。
问题6： Western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？用于Western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？
作为Western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，可以去看看EarthOx他们家的，种类比较全，价格也比较合理。用于Western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带
问题7：半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？
可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
问题8：Western blot哪种染色好？
（1） 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
（2） 胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。
（3） 生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。
问题9：不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？
可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间
问题10： DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么？
DAB显色在辣根过氧化酶的作用能形成一种灰褐色的终末产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料
问题11：酶显色与荧光显色之间，各自的优缺点是什么？
免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的
免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术
问题12：请问资料上所说的PVDF膜可以重复利用是什么意思？可以重复利用几次？
重复利用指的是可以在显影定影完成以后重新洗脱（stripping buffer）然后重新封闭，一抗（可以是不同的，前提是目的蛋白在pvdf膜上），二抗孵育，显影定影。重复利用的情况还要看你的蛋白丰度 ，每一次stripping都会洗掉蛋白，同时有些抗体结合紧的也洗不完全，所以要看你的实验情况而定
问题13：结合ECL之后显影发现胶片上的条带是空心的，而且荧光很快就没了？
一种情况是POD浓度高ECL很快被淬灭掉，导致蛋白丰度越高的地方反而没带，边缘地带反而有显色
问题14：要做磷酸化某因子Western blot，其二抗有何要求？
对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗，EarthOx的质量过硬，价格公道且种类比较全，建议去他们网站查一下。
问题15：Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议：
1）目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
2）一抗特异性不高
重新选择或制备高特异性的抗体，建议去国外品牌网站查一下，比如EarthOx的一抗。
3）一抗不纯
建议同上，或者自己纯化抗体
三、外源基因在大肠杆菌的表达
问题1：外源基因在大肠杆菌中高效表达易形成包含体，包含体形成有利于表达产物的纯化，但降低产生大量不具有生物活性的产物，如何降低包涵体的形成？
解决方案：（1）采用胰胨-磷酸盐培养基能够限制包含体的形成。（2）培养液中加入甜菜碱和山梨醇来改变渗透压，使表达产物由包含体形式转变为活性状态，将温度从37℃降低到25℃时诱导表达，可降低包含体的形成。（3）选用pMBI衍生而来的载体质粒，因为其可以协同表达DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加凝结蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的浓度有关，与表达蛋白的性质有关。
问题2：在lac、tac 表达系统中IPTG 用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG，应如何做？
解决方案：（1）lac 和tac启动子的转录受温度严紧调控：把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使 lac 和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。（2）用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录：乳糖在Β-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。
问题3：T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。
解决方案：在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因：因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。
问题4：为了提高外源基因的表达水平，对表达载体如何进行改进？
解决方案：(l)可诱导拷贝数的表达载体。质粒的拷贝数由培养条件控制，当需要增菌培养时，质粒的拷贝数很低，每个细胞仅1-5个拷贝，经适当条件诱导后，载体拷贝数可达每个细胞100-500个拷贝。这种表达载体的优点减小了载体质粒的丢失，保证质粒在大肠杆菌中的稳定性，对外源基因的表达调控更为严格，有利于基因的高效表达。这里主要有两类条件控制拷贝数的表达载体，一类是基于质粒Rl基础上的单复制起始表达载体；另一类是双复制起始表达载体，一个复制起始来源于Co1EI，另一个来源于质粒pSC101。(2)多顺反子型表达载体。这种表达载体的设计在于将第二个顺反子的SD序列插入在第一个顺反子的终止密码子TAA之前，第一个顺反子要尽量短，后面接目的基因的起始密码子ATG。由于第一个顺反子翻译地有效起始，使得大量的核糖体结合在多顺反子mRNA上，促进了核糖体对第二个顺反子的SD序列的识别和翻译起始，从而提高了表达水平。(3)带翻译增强子的表达载体。atpE基因SD序列上游的一段序列对其表达具有促进作用，它位于SD序列上游2-7bp处，这段序列在atpE基因的mRNA上核昔酸顺序为UUUUAACUGAAACAAA，将其插入到其它表达载体内构建的新型表达载体，对Β-干扰素和IL-2的表达提高了6-8倍。T7噬菌体基因10的mRNA中有一个翻译增强子，它是一段与16sRNA的互补序列，提高了核糖体与翻译起始区的亲和力，将其插入SD序列上游或起始密码子下游均可提高翻译起始效率。
问题5：质粒的过度增殖以及其后目的基因的高效表达影响受体细胞的生长代谢，导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。如何解决？
解决方案：将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道：（1）采用条件控制拷贝数的表达载体，一类是基于质粒Rl基础上的单复制起始表达载体；另一类是双复制起始表达载体，一个复制起始来源于Co1EI，另一个来源于质粒pSC101；（2）将外源基因插入到大肠杆菌的染色体中chopin等报道，将分泌型IGF-I的基因，采用串连式的重复方式插入到大肠杆菌染色体的attλ位点，在不添加抗生素诱导的条件下，采用高密度发酵，IGF-I基因十分稳定。
问题6：在分泌型异源蛋白的表达中，附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质，应如何去除？
解决方案：⑴ 在表达系统中共表达甲硫氨酸氨 |
