我们对RNA 的理解在过去几十年里不断得到发展，RNA不仅仅只承担遗传信息中间载体的辅助性角色，而是更多地承担了各种调控功能。ncRNA在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能极大地解释了基因组复杂性之难题。
对ncRNA的研究主要的手段是对细胞或组织提取的RNA进行定量和定性的分析，常用的方法包括定量PCR，芯片，测序，northern blot等。为了获得ncRNA在细胞及组织中的表达信息，对细胞或组织直接进行RNA检测也是非常必要的，这就需要用到原位杂交的方法。原位杂交的方法可以提供目标RNA在单个细胞内的空间定位，以及结合组织形态学显示在组织中不同类型细胞表达RNA的精确信息。传统RNA原位杂交选择放射性标记、荧光标记或生物素标记的RNA探针，存在特异性差、灵敏性差的缺点，因此在ncRNA研究中的应用受到了很多的限制。
RNAscope 是基于独特的探针设计和信号放大方法的原位杂交方法。它采用类似于荧光共振能量转移(FRET) 的探针设计策略, 两个独立的探针( 双Z 探针) 必须串联杂交到目标序列才能引起信号放大发生，结合在非特异性位点的单个Z探针不会产生一个完整的信号放大分子结合位点，从而防止非特异性信号的放大，显著提高了检测的特异性（见图1）。每个RNA分子只需三对双Z RNA探针结合到目标RNA就可以检测到信号，该方法的高灵敏性使RNAscope平台具有原位检测人类转录组中大多数基因的能力，很多低丰度的RNA也可以清晰的显示空间位置。RNAscope双Z探针的设计方法要求检测的RAN长度要求至少300碱基以上，因此，这个方法已经被广泛用于长链非编码RNA（LncRNAs）的研究。
图1：RNAscope测定在一天内就能完成。制备样品后，加入与目标RNA靶标互补的寡核苷酸探针进行杂交。然后用双Z探针系统放大特异性信号，并立即通过标准光学显微术进行检测和定量。
LncRNA在肿瘤、干细胞、发育等领域研究的都非常火热。以干细胞为例，探讨一下RNAscope技术在LncRNA研究中的应用。
目前研究已经发现了数十种功能性的lncRNA，在干细胞命运决定，x染色体沉默、基因印记、剂量补偿效应、调控蛋白活性、RNA剪切等生命活动中发挥着极广泛的调控作用，并参与到一些重要疾病的发生发展过程中。在LncRNA的机制研究中，首先我们需要确定LncRNA在细胞内的定位，以初步预测LncRNA的可能功能。要进行细胞定位，一种方法是通过细胞核和细胞浆的RNA提取和定量分析，初步推断LncRNA在细胞内的分布。接下来就该RNAscope上场了。原位杂交清晰显示LncRNA的细胞定位及定量情况，为LncRNA的细胞定位提供了最为直接的证据。在细胞水平LncRNA机制研究结束后，就到了体内验证的阶段了。LncRNA没有蛋白产物，因此要在体内检测LncRNA的表达情况，高灵敏度高特异性的RNAscope原位杂交的方法就是最佳选择了。下面以加州大学洛杉矶分校再生医学和干细胞伊莱和伊迪特-布罗德中心(Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA)Lim DA团队最新在cell stem cell上发表的文章，为我们实例演示一下RNAscope在LncRNA研究中的应用[25800779]。为了研究长链非编码RNA Pnky在神经干细胞的神经元分化中的调节作用，利用RNAscope技术，非常清晰的显示长链非编码RNA Pnky在培养的神经干细胞主要表达在细胞核中。进一步体内小鼠脑切片中应用RNAscope原位杂交技术显示Pnky主要在冠状脑区特异性表达。这为下一步研究Pnky对神经干细胞分化调节提供了重要的线索。
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图2 ：The LncRNA Pinky Is Expressed in V-SVZ NSCs and Regulates Neuronal Differentiation。
有关RNAscope应用于研究LncRNA的文章已经在近两年不断发表，我们总结了这些文章的研究内容，并在艾德网站上与大家共享，希望能让这项新的高精准技术普遍应用并在推动我国科学研究中发挥一点力量。
ACD(Advanced Cell Diagnostics.Inc., California, USA)成立于2006年，位于美国加利福尼亚州硅谷中心。作为新兴的分子病理诊断的领导者，开发了RNAscope®专利技术。这是原位杂交领域重大的进步之一，并可应用于精准医疗领域。
RNAscope®实现了单细胞单分子水平的RNA原位杂交定量，具有高灵敏度、特异性，单细胞多重定量，可全自动化高通量，是NGS、芯片等下游理想的转化研究技术平台。
应用RNAscope®进行RNA生物标志物的研究，可应用于肿瘤、感染及免疫、神经、干细胞及发育、非编码RNA、表观遗传学等相关基础医学领域，并已在包括Nature、Science、NEJM等知名国际期刊发表超900篇高水平文献。
