| 本文中，我们会为老师详细解析在做完m6A测序后，如何对差异甲基化的基因进行验证。简单来说就是IP后如何进行qPCR 实验。文中的表述：MeRIP-qPCR与m6A-IP-qPCR等同。
【确定样本起始量和IgG】
在进行讲解之前，我们要回答的第一个问题就是，用多少RNA来做后期验证呢？举个例子，假如要验证10个基因，究竟需要多少total RNA或polyA的RNA才合适呢？
我们先进行一个简单的计算，常规的RT-qPCR 1个反应（1个复孔）需要的total RNA至少0.1-1μg左右。我们按照最小反应起始量来算的话，那么1个反应需要至少100ng的total RNA，3个技术重复（3个复孔），总计total RNA为300ng。
我们知道total RNA中绝大部分为rRNA，那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引物跟目标序列区域进行充分碰撞，那么如果只使用mRNA会大大降低一次PCR反应的起始量。通过计算我们认为5-10ng做1次PCR反应较为合理。也就是1个样本中验证1个基因不做生物学重复只做3个复孔需要至少15ng的mRNA或300ng的total RNA。那么3个生物学重复就需要9个反应，总计45-90ng mRNA或900ng的total RNA。
根据上面的推算，IP下来的mRNA若有500ng，可以验证6-12个基因左右（1个基因3个生物学重复，每个重复3个复孔即技术重复，所以一个基因总计9次反应）。哺乳动物IP效率在10-20%左右，植物在20-40%左右（最高可达50%）。那么假设要验证6-10个基因，哺乳动物需要至少2.5-5μg的mRNA和100-200μg的total RNA，植物样本至少需要1.25-2.5μg的mRNA和50-100μg的total RNA。若加入IgG抗体这个步骤，则需要对total RNA的起始量再次翻倍。
但是如果total RNA太少该怎么处理呢？没关系，可以直接用m6A抗体对total RNA进行IP，而且不用打断。
那么接下来在进行讲解前的第二个问题就是，明明我们做高通量测序只有一个input文库和一个IP文库，为何我们做MeRIP-qPCR 要加入IgG抗体呢（如下图所示）？；
那是因为高通量测序可以对所有被m6A抗体富集下来的RNA进行全转录层面的扫描分析，一旦m6A抗体有非特异性富集，在数据呈现上我们可以明显发现reads的分布比较乱且没有规律，而特异性富集则reads几乎富集在哺乳动物的3’ UTR区和植物的5’ UTR和3’ UTR区。所以这就是测序不需要IgG文库，而我们做m6A-IP-qPCR 需要IgG富集的原因。
搞定了样本起始量和IgG的问题后，我们具体来看下步骤：
【步骤详解】
第一步，先对RNA进行特异性富集。至于打断或不打断，都是可行的。假如要打断的话请在打断之前，确认研究对象只是mRNA还是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠进行富集后再进行打断。如果是lncRNA和mRNA都要研究，则需要先用试剂盒将total RNA的rRNA先消化干净，再进行打断。如果是进行高通量测序打断长度约为100nt左右，而qPCR 则需要长度至少在200nt以上，部分论文甚至打断长度在300-500nt左右甚至都不打断。一般根据文献中的资料显示，IP下来的片段用引物扩增出来的长度在130-150左右，所以100nt不到的长度要设计出合适的引物会非常困难。除非是用5’RACE扩增，否则还是建议大于200nt。当然了，如果不打断的话设计引物就会比较方便。当然如果total RNA本身量比较少，建议老师直接用m6A抗体对total RNA进行富集。
第二步，对RNA进行抗体孵育和特异性富集。打断完了RNA我们会得到长度约为200-300的RNA片段。如果是不打断则是较为完整的RNA全长。这时候我们可以分出约占m6A-IP部分RNA只有10%的RNA作为input。当然如果是细胞样本比较充足，Input和IP的比例可以直接是1:1。如果按照1:1:1，简单来说用于m6A IP的RNA有,3μg，那么Input、IP和IgG的RNA都在1μg左右（无论是total RNA还是mRNA）。
第三步，洗脱和逆转录扩增。接下来我们需要对m6A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA，以及input的RNA，按照常规试剂盒要求进行洗脱，并用随机引物进行逆转录。
第四步，设计MeRIP-qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长度最低会在130-150bp左右。这里需要注意的是，IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录，而第四步中设计的引物用的是特异性引物，这个大家要注意区分和甄别。
第五步，使用上一步设计好的引物，对input、m6A-IP和IgG-IP中的RNA进行qPCR反应并计算相应的CT值。
所以到这里我们的实验部分已经完成了，简单总结下就是想要做够10个左右基因的验证，必须至少提供>200μg的total RNA以上。富集的RNA类型根据自己要求出发，如polyA RNA或rRNA-depleted RNA等，最后就是打断成200-300nt左右的长度。用于qPCR的RNA一共分成3类，即Input、m6A-IP和IgG-IP，其中input占m6A-IP起始量约10%。如果用数字来表示那就是input需要100ng，m6A在IP前需要1μg，IgG在IP前也需要1μg。如果IP:Input:IgG=1:1:1，则不需要做特别复杂的换算。部分课题组甚至会舍弃IgG，只有IP和Input，分别为1:1。
所以接下来我们就要详细讨论下m6A-IP-qPCR 是如何计算相对表达量的。MeRIP-qPCR 是m6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我们就能发现，m6A-IP-qPCR基本和常规的RIP-qPCR相似。当然在讨论RIP-qPCR之前，我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。
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